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醫學Nanopore全長轉錄組測序

產品介紹

ONT全長轉錄組測序是指基于牛津納米孔公司(Oxford Nanopore Technologies,ONT)三代測序平臺進行全長轉錄組測序。

全長轉錄組測序(full-length transcriptome sequencing),又稱Isoform Sequencing(Iso-Seq),無需打斷,基于三代測序平臺直接獲取轉錄本的5ˊ到3ˊ高質量全長序列,便于檢測轉錄本結構變異。

基于nanopore三代測序平臺進行全長轉錄組測序,除了可準確鑒別轉錄本結構變異,還可準確定量轉錄本(mRNA或polyA+ lncRNA)表達水平。

技術路線

真核生物中約95%轉錄本具有可變剪接、65%具可變起始位點,以及70%以上轉錄本具有可選擇性多聚腺苷酸APA現象,另外基因融合也是一種癌癥驅動因素,這些表明轉錄本結構變異是調節基因表達多樣性和產生蛋白質多樣性的重要原因。

產品參數

建庫策略 數據量 產品周期 樣本要求
polyA nanopore全長轉錄組文庫 6Gb clean data以上 3個月 總量:≥3ug常規; 完整性:RIN值>8

應用方向

?結果展示

3
lncRNA預測分析
4
轉錄本和基因差異表達分析
1
可變剪接分析-AS
2
可選擇性多聚腺苷酸化分析-APA

?常見問題

nanopore全長轉錄組測序與二代Illumina平臺普通轉錄組的區別?

主要在于測序平臺不同。Illumina平臺主要是PE150測序,構建小片段文庫,為邊合成邊測序,在建庫以及測序過程中均需要PCR擴增,主要用于基因水平表達定量及差異表達分析。nanopre全長轉錄組測序無需打斷RNA,可獲得5’到3’全長轉錄本序列及其表達信息,對片段大小無偏好,直接檢測電信號無需邊合成邊測序其GC偏好性遠低于二代平臺;同時由于無需拼接其在轉錄本層面的結構變異檢測方面,比如可變剪接、融合基因、APA、新基因預測等具有絕對優勢。

nanopore全長轉錄組測序送樣要求?

樣品類型:PolyA RNA;樣品濃度:≥50 ng/ul(Qubit HS RNA定量); 樣品總量:cDNA-direct方式:>250ng(單次);總量>750 ng;(若提供總RNA,動物樣品總量需按照PolyA RNA要求的100倍以上準備); cDNA-PCR方式:>1μg(單次);總量>3μg 樣品純度:OD260/280 ~2.0,OD260/230在2.0-2.2 之間,260nm處有正常峰值;樣品無基因組DNA污染; 總RNA完整性: RIN值≥8.0,28S/18S≥1.0;圖譜基線無上抬;5S峰正常。

nanopore全長轉錄組測序一般建議多少個生物學重復?

研究表明,生物學重復可提高所有基因表達水平鑒定的準確性,而增加測序深度主要提高低表達基因表達量鑒定準確性。每種處理條件下至少3個生物學重復,當研究樣本的生物學差異比較高,或者想研究更多的微小表達差異/fold change時,需要更多生物學重復。也就是,比如對于個體差異較大的臨床樣本可以5-10個/組以上,而生物學差異較小的細胞系樣本則每組3個生物學重復以上即可。

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