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Small RNA測序

產品介紹

small RNA測序是生命活動重要的調控因子,在基因表達調控、生物個體發育、代謝及疾病的發生等生理過程中起著重要的作用。Illumina能夠對細胞或者組織中的全部Small RNA進行深度測序及定量分析等研究。

miRNA鑒定

miRNA轉錄起始位點多位于基因間隔區、內含子以及編碼序列的反向互補序列上,其前體具有標志性的發夾結構,成熟體的形成是由Dicer/DCL酶的剪切實現的。對于已知miRNA的鑒定,我們將比對上參考基因組的reads序列與已知miRNA數據庫miRBase(v21)中的成熟miRNA序列進行比對。針對miRNA的生物特征,對于未鑒定到已知miRNA的序列,百邁客利用miRDeep2軟件進行新miRNA的預測。

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基因表達水平分析

利用轉錄組數據檢測基因表達具有較高的靈敏度。通過FPKM密度圖和箱線圖不僅可以反映單個樣品基因表達水平分布和離散程度,還可以直觀的比較不同樣品的整體基因表達水平差異。

差異表達miRNA聚類分析

聚類分析用于判斷差異基因在不同實驗條件下的表達模式,可通過將表達模式相同或相近的基因聚集成類,從而識別未知基因的功能或已知基因的未知功能,同類基因可能具有相似的功能或共同參與同一代謝過程。對篩選出的差異表達miRNA做層次聚類分析,將具有相同或相似表達行為的miRNA進行聚類。

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差異miRNA靶基因注釋

生物體內,在特定條件下某些基因對應的轉錄本會形成miRNA前體,失去編碼功能,從而影響生物學表型。因此,針對miRNA的靶基因分別進行GO和KEGG注釋及富集分析,有助于深入挖掘小RNA功能。

Q1. 動植物在miRNA預測中有什么差別:

答:植物miRNA可與mRNA的編碼區完全互補配對,并通過誘導mRNA降解而發揮抑制表達的作用,我們可以直接通過比對來篩選靶基因
動物miRNA則可與mRNA的3’UTR區部分互補配對結合,進而抑制翻譯的進行,一般的,miRNA與mRNA的配對區域位于miRNA的5’端的 2-8個堿基,稱為種子區,只要種子區能與mRNA互補配對即可發揮作用,這也是一個miNRA能夠調控數百條mRNA的原因。
①對于動物預測靶基因我們不是直接通過比對進行篩選的。
②在動物預測時,由于我們沒法給出3‘utr區,因此我們截取mRNA5’端前2000bp使用動物預測靶基因方法進行預測,target_length指的就是我們截取該基因的長度。

Q2. 分析結果中如何確定miRNA對應的pre-miRNA的數量(別人論文中有這樣的結論:We identified 83 potential novel miRNAs, which corresponded to 95 genomic loci.)?

答:文獻中的描述是指某些成熟的miRNA序列可能來自于不同的miRNA前體序列,無參項目中分析的novel miRNA是針對每個Unigene分析的,命名也是與Unigene對應,沒有對成熟miRNA的序列進行重復的分析。對成熟的miRNA的序列進行去重復統計,例如某項目預測出了229個miRNA,其中有6個miRNA分別來自于兩個不同的前體序列,故可表述為:預測出了223個miRNA,對應了229個前體序列。

Q3. 目前對于小RNA靶基因的結果驗證方法有哪些?

答:

  1. RT-PCR對miRNA進行定量驗證;
  2. miRNA過表達;
  3. 熒光素酶法,過表達miRNA測定靶基因表達量;把靶基因連上一個熒光素酶,如果靶基因表達量下降,可檢測到的熒光信號則減弱
  4. 降解組測序
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